plantarum (plantarum) wrote,
plantarum
plantarum

Categories:

не уничтожайте неудавшиеся фотографии

Никогда не уничтожайте неудавшиеся снимки. Никогда не знаешь, не пригодятся ли они двадцать лет спустя.

Планировала когда ни будь про это написать красиво, но тут нешуточные страсти разгорелись после публикации flavorchemist, там ссылка на феерический текст совершенно, про "... Эфирное Масло это одна из самых загадочных субстанции на планете Земля. Никто еще не смог понять его суть полностью, и измерить его силу... " Пост задел за живое, журнал нашедшего феерическое и подкинувшего ссылку вообще удалили. Пост вот тут . Ответная реакция вот тут . По одну сторону баррикады солидная косметическая фирма со знаниями "от магов древней Месопотамии и Египетских жрецов", по другую - циничные химики.

Задела меня эта история вот почему.

Давным давно, когда я ещё не была работником торговли, а была сотрудником Академии Наук, моим объектом были эфирномасличные растения. Если совсем конкретно - я рассматривала под электронным микроскопом клетки, которые эти самые эфирные масла производят. Первыми моими подследственными были растения, относящиеся к семейству яснотковых (губоцветных) - змееголовник и котовник. Это семейство по части эфирных масел на первом месте стоит. Мята, мелисса, лаванда, пустырник, иссоп, розмарин, шалфей, чабер, базилик, монарда, душица. Эфирные масла в них образуются в вот таких вот симпатичных штуковинах, похожих на летающие тарелки, которые расположены на поверхности листьев, чашелистиков, реже - на стебле.



Получить такую красивую картинку не очень сложно, если есть соответствующая техника и реактивы. Подробно о том, как это делается можно посмотреть вот тут.

Гораздо сложнее процедура, если хочется заглянуть внутрь клеток.

Для этого нам понадобится просвечивающий (трансмиссионный) электронный микроскоп.
Например, вот такой.


отсюда: http://nanopedia.case.edu/NWPage.php?page=in.bjh7.011

У нас попроще были. Но это не так уж важно. Эта штука вот как работает. В колонну помещают образцы, которые собираются изучить, через них проходит пучок электронов. Дальше пучок попадает на экран, покрытый флуоресцирующим веществом. Там, где по пути электроны задержались, видим тёмные пятна, где прошли беспрепятственно - светлые. Это как слайды смотреть: пропускаем лучи через пленку с изображением, и на экране его видим. На картинке экран закрыт белой как сам микроском крышкой, внизу колонны. Под экраном в микроскопе расположены фотопластинки (ящичек по центру тумбы), нужный участок можно сфотографировать.

Но прежде, чем мы сможем рассматривать наш интересный объект в микроскоп, этот объект надо к исследованию подготовить.

Часть первая. Готовим эфирномасличное растение к исследованию.
Можно пропустить, подивившись размеру её, и сразу перейти к второй части.

Сначала клетки нам нужно убить. Причем сделать это очень быстро. Всё, что у клеток внутри, должно застыть мгновенно, как по команде "замри". Тогда мы сможем этот "стоп-кадр" изучать сколько влезет. Для фиксации обычно используют последовательно два вещества. Сначала образцы, это должны быть очень маленькие кусочки, примерно 2х4 мм, в нашем случае малюсенькие листочки из почек целиком или аккуратно отрезанные участки листьев, помещают в буферный раствор глутарового альдегида. Все реактивы у нас весьма дорогие, поэтому пользуемся малюсенькими пробирками, на 1 мл. Оно и удобнее.

Мы решили исследовать клетки растений, а не животных, и это решение создаст нам дополнительные трудности. У растений во-первых есть клеточная стенка, которая мешает проникновению фиксатора в клетки, а между клетками имеются обширные воздушные полости - межклетники. Наш фиксатор не очень хочет проникать внутрь листа из-за поверхностного натяжения, поэтому воздух из межклетников надо удалить. Удаляют воздух медленно, с помощью ручного насоса Камовского, и в несколько приёмов.

Это очень любопытный процесс. Пробирки в открытом виде помещают в колбу Бунзена и присоединяют к насосу. И начинают крутить ручку, откачивая воздух. Сначала на торцах наших листочков, там, где прошел срез, появляются мелкие пузырики газа, по мере того, как воздух уходит из колбы пузырики превращаются с пузырищи и, в какой то момент, лопаются. Важно, чтобы это не произошло быстро, лопнувший пузырь может выплюнуть из пробирки весь фиксатор с листиками вместе. Откачка длится примерно час. После этого большинство образцов можно хранить в фиксаторе неделями. Например, нафиксировать кучу всяких интересностей в экспедиции, а потом возиться с этим добром зимой в лаборатории. Только с эфиромасличными растениями этот номер, как выяснилось, не проходит. Поэтому переходим сразу ко второму этапу фиксации.

       
колба Бунзена слева, насос Камовского справа
отсюда:http://www.laborkomplekt.ru; http://uchteh.ru


Сливаем глутаровый альдегид, промываем образцы несколько раз буфером. Дрожащей рукой додстаём из холодильника буферный раствор четырехокиси осмия. Радуемся, что он не закончился, а то пришлось бы его готовить. Осмий воняет. Мерзкий холодящий запах. Он по настоящему ядовит, а я страшная трусиха. Работаем только в вытяжном шкафу. По уму должны быть и специальные ёмкости для сбора отходов, которые "обязательно увезут на полигон". В добрые восьмидесятые уже никто не увозил, сливали в землю на заднем дворе. Благо осмий быстро испаряется.

В осмии образцы наши проведут целую ночь. Утром уберем осмий из пробирок, промоем пару раз буфером и начнем потихоньку из листьев удалять воду. Сначала меняем буфер на 30-градусный спирт, потом повышаем градус спирта - до абсолютного. Шаг - 15 градусов.

Отечественная методика предполагает один нюанс. В промежутке, когда образцы находятся в 70 градусном спирте помещаем их на пару часов в раствор уранилацетата. Зарубежные коллеги обычно так не делают. Мне кажется, они правы.

Из абсолютного спирта наши образцы перемещаются в абсолютный ацетон. Пока они там болтаются приступаем к следующей части процедуры - готовим смесь эпоксидных смол. Для этих целей у нас в лаборатории имелась специальная магнитная мешалка, без неё процедура была бы просто невыносимой. Рецептуру приготовления смолы опускаю, мы и так ещё до середины процесса не дошли.


Эпоксидные смолы отсюда: http://www.electronmicroscopysciences.com

Смола растворяется в ацетоне, в спирте гораздо-гораздо хуже. Для того мы спирт в наших пробирочках ацетоном заменили. Теперь медленно-медленно будем пропитывать образцы смолой. Готовим раствор смолы в ацетоне 9,5:0,5. Заливаем этим раствором образцы - на ночь.

Пошел третий день работы. Вчерашний был, кстати, самым тяжелым. На третий день раствор в пробирках мы меняем всего несколько раз, каждый раз добавляя в ацетон на одну часть смолы больше. К вечеру там будет уже меньше половины ацетона.

Наутро, придя в лабораторию, открываем пробки у пробирок. Ацетон потихоньку испаряется, концентрация раствора увеличивается. Через пару часов можно будет раскладывать наши образцы по ячейкам, чтобы залить их окончательно смолой и поставить полимеризоваться.


В такие формочки раскладывают образцы и заливают эпоксидной смолой. Отсюда http://www.canemco.com

Что это за ячейки? Сейчас я вам всё про них расскажу. В дивные восьмидесятые только счастливчики, имевшие связи с "тамошними" учеными могли позволить себе специальные силиконовые формочки, удобные и экономичные. На них даже номера выдавливались, чтобы потом блоки сортировать. Советские же ученые не нуждались в таких извращениях. Для заливки материала использовались упаковки от таблеток.

О! Это целое искусство - подобрать правильную таблетницу под блоки. Хорошо, если в лаборатории в избытке пожилые больные сотрудники. Такое дело, как добыча таблетниц, на сторону не отдашь. Таблетки из них нельзя выдавливать - только аккуратно вытряхивать, чтобы не деформировать ёмкость. Таблетница от аллохола не подойдёт. У неё дно не плоское. Димедрол тоже не катит - слишком маленькие, не захватить держателем. Потом важен материал таблетницы. Бывают слишком хрупкие, а бывают наоборот, чересчур мягкие, они к смоле прилипают. Правильную таблетницу можно узнать только на ощупь.

Укладываем мы наши образцы в таблетницы (один образец - одна таблетка), заливаем смолой и ставим на трое суток в термостат. Весь следующий день отмываем посуду от эпоксидки ацетоном, размышляя о пионерах-авиамоделистах, проводящих часы за клейкой своих моделей из эпоксидной смолы.

На третий день вынимаем наши блоки из термостата. Теперь их надо нарезать слоями, толщиной в 0.0001 мм. Начинаем мы с того, что лобзиком обтачиваем блоки из таблетниц, превращая их в импортные аналоги. Это ничего, что 2/3 смолы уйдёт в помойку, деньги то государственные. Вот сейчас всё не так, как раньше, сейчас у каждого имеются вожделенные фирменные блоки и расход смолы сократился в разы.

Блоки захватываются специальным держателем и помещаются в прибор под названием микротом. Верхушка блока обтачивается бритвой (под бинокулярной лупой) в пирамидку. С помощью микротома мы получаем довольно толстые срезы. Он нужен для того, чтобы найти на блоке правильное место, и уже на этом месте сделатьещё меньшую усеченную пирамидку, с площадью поверхности всего пару квадратных миллиметров. Слой за слоем снимаем срезы. Вот мы дошли до желёзки. Теперь подправляем блок с помощью бритвы, доводим его до нужного размера, и несем вместе с держателем на ультратом.

       
Так выглядит ультратом, дизайн разный бывает, конечно. Отсюда: http://www.medwow.com Справа - держатели для блоков.

Ультратом позволяет делать срезы толщиной 0,1 мкм. В нём используются специальные ножи. Когда я начинала работать, в распоряжении наших сотрудников были только стеклянные ножи. Их делали непосредственно перед работой из специального стекла на приборе под названием найфмейкер. К ножу приклеивается пластиковая ванночка. В неё наливают воду. Наши срезы будут сниматься с тонкой стеклянной грани и останутся на поверхности воды, точнее - 10% спирта.

       
Прибор для изготовления стеклянных ножей. Ломает специальное стекло под определенным углом. Отсюда: http://www.tedpella.com Справа - стеклянные блоки, из которых делают ножи. Отсюда: http://www.emsdiasum.com

Стеклянный нож нельзя сделать заранее, за неделю стекло оплывает и режущая поверхность портится. Во всех современных лабораториях уже в восьмидесятые годы пользовались алмазными ножами. Старые, ножи дарили советским коллегам - трофей и предмет зависти. Сейчас вполне можно позволить себе купить алмазный нож, если есть грант.


Алмазный нож, он встроен в ванночку. Голубая мечта. Отсюда: http://www.canemco.com

Ну, нарезали мы себе срезиков хорошеньких, и что с ними делать теперь? Теперь у нас есть сеточки вот такие,, диаметром около 3 мм, в промежутке между тонкими полосками-перегородками поместится несколько срезов.
Чтобы срезы не провалились, мы заранее эти сеточки приклеили к тоненькой плёнке из формвара, эта работа заняла у нас целый день, зато сеточек теперь хватит надолго. Берем сеточку плёнкой вниз и кладём её на срезы. Срезы прилипли к плёночке.

Теперь подсушим сеточку и положим её в контрастирующий раствор. Сначала - в каплю уранилацетата, а потом, промыв, в каплю цитрата свинца. И уран и свинец - тяжелые металлы, они будут задерживать электроны в микроскопе.

Ну вот, наши образцы готовы к исследованию. Всего какие то две недели на всё про всё.

Часть вторая. Что мы видим под микроскопом.

Наконец с нашими драгоценными сеточками чуть дыша садимся мы за микроскоп и готовимся узнать всё про производство эфирных масел внутри живой клетки. И...

Облом! Полный облом. В клетках следы страшной разрухи. Половина - черным черна. Там, где что-то видно видно мембраны все порваны, от органелл одни ошмётки и на всём, на всём - омерзительные тёмные пятна.

Это значит, что ничего у нас не получилось, причем на самом первом этапе. Нам не удалось очень быстро "остановить" клетку. Проницаемость мембран чуть-чуть изменилась, и заключенное внутри клеток в специальных ёмкостях-вакуолях эфирное масло попало за пределы своего хранилища. И всё кругом порушило. Потому, что терпены, из которых большей частью эфирные масла состоят, очень агрессивны, и попав в клетку разрушают её быстрее, чем её успевает зафиксировать наш фиксатор.

И начинается мучение. Стандартная методика не подходит, нужно пробовать как то по другому. Сотрудники помогают советами. А если добавить в фиксатор сахарозу? А если таннины? Может, поменять кислотность буфера? Поставить пробирки на лёд. Наоборот, не ставить в холодильник осмий.

И каждый такой эксперимент - морока на две недели. Даже если объединять эксперименты. И раз за разом эфирное масло успевает разгромить свой завод быстрее, чем я успеваю его зафиксировать.

Мне повезло, и правильную методику я таки подобрала. Это был раствор формглютара вместо просто глютара, и всякие хитрости со временем и температурой фиксации. Она не на всех растениях сработала, но некоторое количество губоцветных поддалось.


Такая картинка видна под электронным микроскопом если всё удачно получилось. Это - котовник кошачий, фрагмент клетки, поизводящей эфирное масло.

А неудачные снимки я, понятно, выкидывала. Нужны они мне?

Оказывается, нужны. Сейчас я бы могла показать, что случается с клеткой , если эфирное масло бесконтрольно проникает внутрь. Растение предпринимает немало защитных мер, чтобы оно не ушло за пределы окруженного мембраной пузырька, или не просочилось по клеточным стенкам и не достигло обычных клеток листа.

Часть третья. Про ароматерапию.

Мне кажется, что выбирать лекарство по запаху не менее странно, чем выбирать его по цвету. "Настоем оранжевых лепестков полощите горло". Хотя, прочитала тут на днях, что некогда пытались лечить оспу, заворачивая больных в ткань красного цвета.

Некоторые компоненты эфирных масел обладают доказанным медицинским эффектом. Камфора, например. Эфирное масло аниса (Капли Датского короля) - хорошее отхаркивающее средство. Только их запах тут ни при чём. Он присутствует как одна из характеристик препарата.

Часто говорят про успокаивающее действие эфирных масел. Вполне возможно. С запахами у нас многое связано. Воспоминания. Корица, апельсин - Новый год, ёлка, подарки. Хорошо, уютно. А вот запах мяты и пустырника, если войти в квартиру, а там мятой и пустырником пахнет - естественно, тревожно. С чего это тут сердечные-успокаивающие открывали. Иланг-иланг. Афродизиак. Уж не знаю, опознает ли средний европеец этот аромат. У жителей Юго-Восточной Азии при этом он, вполне возможно, вызывает определенные ассоциации.

Воздействие ароматов на психику ещё изучать и изучать. Скорость реакции, восстановление после утомления. Главная проблема в том, чтобы в повторных опытах использовали одни и те же смеси веществ. Это при том, что терпены так быстро окисляются на воздухе, что через час после вскрытия пузырька там уже состав немного другой. И как тогда результаты сравнивать?

Кто дочитал до конца - просто герой. Вот.
Tags: как это устроено, эфирномасличные растения
Subscribe
  • Post a new comment

    Error

    default userpic

    Your reply will be screened

    Your IP address will be recorded 

    When you submit the form an invisible reCAPTCHA check will be performed.
    You must follow the Privacy Policy and Google Terms of use.
  • 45 comments